refik.in.ua 1

T3, свободный (EIA-2385)


Для количественного определения Свободного Трииодтиронина.

Вступление

L-Трииодтиронин, тироидный гормон, циркулирует в крови преимущественно в связанном виде ( > 99,5 %) с белками-переносчиками. Основной транспортный белок – это тироксинсвязывающий гормон (ТСГ). Тем не менее, только свободная (несвязанная) фракция трииодтиронина ответственна за исполнение биологической роли. Тем более концентрации переносчиков изменяются при многих клинических состояниях (напр., беременность). У людей с нормальным функционированием щитовидной железы при изменении концентрации переносчиков изменяется соответственно и концентрация общего Т3, тогда как свободный Трииодтиронин (сТ3) остается на прежнем уровне. Поэтому измерения сТ3 более надежные в отношении клинического состояния, чем уровень общего Т3. Например, повышение общего Т3 связано с беременностью, приемом оральных контрацептивов; эстрогеновая терапия вызывает повышение общего Т3, в то время как концентрация сТ3 в основном остается неизменной. Этот микропланшетный ИФА-метод позволяет с помощью нескольких манипуляций определить напрямую сТ3.

Принцип анализа

Тест на сТ3 – твердофазный конкурентный ИФА. Образцы сыворотки пациента, стандарты, контроли и Т3-ферментный рабочий реагент добавляются в лунки, покрытые моноклональными антителами к Т3. сТ3 в образце пациента и Т3-меченный конъюгат конкурируют за связывание с доступными сайтами связывания антитела. После 60 минут инкубации при комнатной температуре лунки промываются водой для удаления несвязавшегося конъюгата. Затем добавляется раствор H2O2/ТМБ, и смесь инкубируется 20 минут, вырабатывая синее окрашивание. Выработка окрашивания прекращается добавлением 3 н HCl. Спектрофотометрически измеряется абсорбция при 450 нм. Интенсивность окрашивания пропорциональна количеству фермента и обратно связана с количеством немеченого сТ3 в образце. По соотношению к серии стандартов сТ3, проанализированных тем же путем, считается концентрация сТ3 в образце пациента.


Реагенты, включенные в набор:


  1. Микропланшета с 96-лунками, покрытыми антителами к Т3

  2. Ферментный конъюгат (11Х), 10,5 мл, готов к использованию

  3. Референс-стандарты сТ3, по 1,0 мл, готовы к использованию:

0; 0,9; 2.2; 5,0; 9,0 и 19,0 пг/мл – 1 набор, готовы к использованию

Для системы СИ: 1 пг/мл × 1,536 = пмоль/л

  1. Цветной реагент А, 13 мл

  2. Цветной реагент Б, 13 мл

  3. Стоп-раствор, 10 мл (3 н HCl)

Материалы, не включенные в набор, но необходимые

  • Пипетки для раскапывания 50 мкл объема с точностью выше, чем 1,5 %.

  • Диспензеры для повторного раскапывания на 0,050 мл и на 200 мл с точностью выше, чем 1,5 %.

  • Микропланшетный ридер с возможностью считывания при 450 нм.

  • Емкости для приготовления конъюгата и цветных реагентов.

  • Абсорбирующая бумага

  • Таймер

  • Контрольный материал

Забор и подготовка образцов

Сыворотка приготовляется из пробы цельной крови обычным способом. Данный набор предназначен для работы только с образцами без добавок. Образцы сыворотки могут храниться при 2 – 8 °С максимум 48 часов. До 30 дней образцы могут храниться при – 20 °С.

Хранение набора

Закрытый набор хранить при 2 – 8 °С, а микротитровальную панель – в закрытом пакете с влагопоглотителями. Вскрытый набор стабилен до даты срока годности, при условии хранения как описано выше.

Подготовка реагентов

  1. Все реагенты должны иметь комнатную температуру (18 – 25 °С) перед началом исследования
  2. Для приготовления раствора субстрата H2O2/TMB, приготовьте 1:1 смесь цветного реагента А и цветного реагента В. Тщательно перемешать. Приготовить реагент за 1 час до использования, по крайней мере, он должен быть готов за 15 минут до проведения анализа. Приготовленный реагент стабилен при комнатной температуре при хранении в темноте до 3 часов.


Процедура исследования

  1. Установить в держателе необходимое число лунок. Пробы пациентов должны исследоваться в дублях.

  2. Раскапать 50 мкл стандартов, образцов, и контролей в соответствующие лунки.

  3. Раскапать 100 мкл конъюгата в каждую лунку.

  4. 20 - 30 секунд слегка покрутить плашку для смешивания реагентов.

  5. Инкубировать при комнатной температуре (18 – 25 °С) в течение 60 минут.

  6. Удалить инкубационную смесь. Тщательно промыть плашку 5 раз дистиллированной или деионизованной водой. Резко постучать лунками по абсорбирующей бумаге или полотенцу, чтобы удалить оставшиеся капли влаги.

  7. Раскапать 200 мкл H2O2/ТМВ Субстрат - раствора в каждую лунку. Всегда добавляйте реагенты в одинаковой последовательности, чтобы сократить до минимума разницу во времени реакции между лунками. Аккуратно помешать 10 сек.

  8. Инкубировать при комнатной температуре в темноте в течение 20 минут.

  9. Остановить реакцию добавлением 50 мкл 3 н HCl в каждую лунку.

  10. Тщательно перемешать в течение 30 секунд.

Важно убедиться, что голубой цвет полностью сменяется желтым.

  1. Считать абсорбцию при 450 нм в течение 30 минут.

Подсчет результатов

  1. Подсчитать средние величины абсорбции (А450) для каждого набора референс-стандартов, контролей и образцов.

  2. Построить стандартную кривую соотношением средней величины абсорбции, полученной для каждого референс-стандарта, против его концентрацией в пг/мл на линейной миллиметровой бумаге, с абсорбцией на вертикальной (У) оси и концентрацией на горизонтальной (Х) оси.

  3. Используя среднюю величину абсорбции для каждого образца, определите соответствующую концентрацию свободного Т3 в пг/мл от стандартной кривой.

Пример стандартной кривой

Данная стандартная кривая приведена лишь в качестве иллюстрации и не может использоваться для вычисления неизвестных.


Свободный Т3 (пг/мл)

Абсорбция (450 нм)

0

2,478

0,9

1,862

2,2

1,483

5,0

0,927

9,0

0,576

19,0

0,338



Характеристики анализа


  1. Верность

Тест-система сТ3 ИФА была сравнена с РИА на покрытых трубочках. Для анализа были взяты биопробы при гипер-, гипотиреозе и нормальные образцы (значения от 0,1 – 14 пг/мл). Общее число таких образцов 85. Уравнение регрессии наименьших квадратов и коэффициент корреляции для данной тест-системы были посчитаны по сравнению с референс-методом. Данные приведены ниже:

Метод

Среднее

Уравнение регрессии

Коэффициент

Данный

3,4

y=0,15+0,925х

0,955

Эталонный

3,5






Лишь небольшие отклонения данного метода от эталонного метода показаны близостью средних значений. Уравнение регрессии и коэффициент корреляции отличное схождение результатов.

  1. Точность

Внутри- и межпостановочная точность исследования Тест-системы сТ3 были определены с тремя уровнями контрольной сыворотки. Количество, средние значения, стандартное отклонение и коэффициент вариации приведены ниже

Внутрипостановочная точность (значения в пг/мл)

Образец

Кол-во

Среднее

Ст. Откл.

КВ (%)

Низкий

20

1,37

0,16

11,9

Норма

20

4,21

0,17

4,1

Высокий

20

7,1

0,17

2,4

Межпостановочная точность (значения в пг/мл)*

Образец

Кол-во

Среднее

Ст. Откл.

КВ (%)

Низкий


10

1,4

0,15

10,7

Норма

10

4,4

0,23

5,2

Высокий

10

7,0

0,30

4,2

*Измерено в 10 экспериментах в дублях в течение 10 дней.

  1. Специфичность

Перекрестная реактивность антитела Т3 с отдельными веществами была получена добавлением мешающих веществ с различными концентрациями в сывороточный матрикс. Она подсчитывается получением частного от дозы мешающего вещества к дозе Т3, необходимой для замещения того же количества следового вещества.

Вещество

Перекрестная реактивность

Концентрация

I-Трииодтиронин

1,0000

-

I-Тироксин

<0,0002

10 мкг/мл

Иодтирозин

<0,0001

10 мкг/мл

Дииодтирозин

<0,0001

10 мкг/мл

Дииодтирозин

<0,0001

10 мкг/мл


Фенилбутзон

<0,0001

10 мкг/мл

Натрия салицилат

<0,0001

10 мкг/мл

  1. Чувствительность: 0,05 пг/мл

  2. Ожидаемые значения




Среднее

Ст. Откл.

Ожид. Знач.

Взрослые

(110 образцов)

2,8

0,7

1,4 – 4,2

Беременные

(30 образцов)

3,0

0,6

1,8 – 4,2

Важно понимать, что определение значений, которые могут быть получены с помощью данного анализа от «здоровых» людей, зависит от нескольких факторов: специфичность метода, особенность населения и точность исполнения (зависит от исполнителя). Поэтому настоятельно рекомендуется лабораториям разработать свои собственные нормы. Нормы производителя набора получены от окружающего население и того места, где расположена лаборатория.

Клиническая значимость

Различия в концентрациях белков-транспортеров будут влиять на связанный с ними уровень общего Т3, в то время как физиологически активный сТ3 останется на том же уровне у здоровых пациентов. Поэтому определение сТ3 может дать гораздо больше полезной информации о состоянии щитовидной железы, чем определение общего Т3. Завышенный уровень сТ3 говорит о гипертиреозе, заниженный – о гипотиреозе.


Ограничения процедуры


  1. Надежные и читаемые результаты получатся только в случае полного понимания инструкции и приверженности лабораторной практике.

  2. Процедура промывки очень важна. Недостаточная промывка отражается на точности и дает ложно завышенные значения.

  3. Образцы сыворотки жирные, гемолизные или мутные не должны использоваться в данном тесте.

  4. Результаты, полученные при использовании данного набора, должны служить только как дополнение к диагностическим процедурам и информация, доступная терапевту.


Пересмотрено 27.05.2006