refik.in.ua 1

DRG Кортизол EIA-1887


DRG твердофазный иммуноферментный анализ для количественного измерения кортизола в сыворотке

Версия 1.0

96 анализов

ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ ДЛЯ ПОЛЬЗОВАТЕЛЕЙ


  1. Все компоненты набора, содержащие сыворотку или плазму крови человека, проверены на наличие компонентов вируса Гепатита Б, ВИЧ (HIV) и признаны безопасными. Однако, все продукты, содержащие компоненты человеческой крови, должны рассматриваться как потенциально инфицированные. Поэтому при работе с ними необходимо соблюдать все меры предосторожности, установленные в лабораторной практике.

  2. Избегайте контакта кожи со Стоп-раствором 0,5Н H2SO4 .Это может вызвать раздражения и ожоги.

  3. Немедленно после использования закройте реагенты крышками. Не путайте крышки от реагентов.

  4. Расторы, содержашие добавки или консерванты, такие как азид натрия, не должны использоваться в ферментной реакции.

  5. Не брать реагенты в рот.

  6. Только для диагностики ин-витро.

  7. Не используйте в исследовании компоненты из наборов разных лотов.


Состав набора и приготовление рабочих растворов

1. Микропланшет с лунками, покрытыми антителами 12 стрипов по 8 лунок

2. Кортизол -калибраторы 7 флаконов

3. Конъюгат пероксидаза хрена –кортизол 1 флакон

4. Промывочный буфер 1 флакон

5. Субстрат раствор 1 флакон

6. Стоп-раствор 1 флакон

Дата срока годности набора напечатана на этикетке коробки

По получении хранить набор при 2-8°C.

Микропланшета с лунками, покрытыми антителами


Каждая лунка покрыта мышиными антителами к кортизолу. После первого вскрытия пакета стрипы стабильны в течение 8 недель при хранении при 2-8°С в плотно закрытом пакете с влагоуловителем.

Кортизол калибраторы

Готовы к использованию. Содержат стандарт кортизола в человеческой сыворотке. Концентрации кортизола: 0, 20, 50, 100, 200, 400, 800 нг/мл, что соответствует 0, 55.2, 138, 276, 552, 104, 2208 нмоль/л (коэффициент пересчета: 1 нг/мл = 2,76 нмоль/л).

Объем всех калибраторов 1 мл. Хранить при 2-8°С. Стабильны в течение 8 недель после вскрытия.

Конъюгат пероксидаза хрена-кортизол


Готов к использованию. Содержит 25 мл конъюгата в буферных добавках ферментных стабилизаторов и кортизол-связующих заместителях.

Хранить при 2-8°С. Стабилен в течение 8 недель после вскрытия.

Промывочный буфер


30 мл промывочного буфера (в концентрации 40Х). Приготовить рабочий раствор перемешиванием содержимого с 1170 мл дистиллированной воды. Стабилен в течение 8 недель при хранении при комнатной температуре.

Хромоген (TMB)/Субстрат (H2O2) Раствор - LS –Реагент, готовый к использованию.

Содержит 14 мл стабилизированной смеси TMБ (3,3’,5,5’ Tetramethylbenzidine) и H2O2. Хранить при 2-8°С. Стабилен в течение 8 недель после вскрытия при 4°С и 2 недели при комнатной температуре.

ЗАМЕЧАНИЕ

ИФА наборы для исследования стероидов содержат 2 различные формулы TMB/H2O2 раствора. Первая формула маркирована как LS (Low Sensitivity-низкая чувствительность) и используется для ИФА наборов на кортизол и ДГЕА-С; Другая маркирована как HS (High Sensitivity-высокая чувствительность) и используется для всех других ИФА стероидных наборов. НЕ ПУТАТЬ “LS” с “HS” растворами

TMB/H
2O2 - бесцветный или слегка желтовато-голубоватый раствор. В случае загрязнения раствор начинает принимать голубой цвет и должен быть утилизирован.

Во избежание загрязнения, если необходимо использовать одну часть содержимого бутылочки, перенесите необходимое количество в чистый пластиковый контейнер, предварительно промытый этанолом и затем отмытый высококачественной дистиллированной водой. Раствор TMB/H2O2 не чувствителен к свету. Однако, прямые солнечные лучи могут вызвать окислительный процесс и раствор станет голубым. В этом случае цвет исчезает после хранения в течение 4 часов в темноте и раствор снова пригоден к использованию.

Стоп-раствор


Готов к использованию. Содержит 14 мл 0.5M H2SO4. Хранить при 2-8°С.
Необходимые, но не входящие в набор материалы

Прецизионные пипетки с одноразовыми наконечниками (20 мкл).

Полуавтоматическая пипетка для повторяющегося раскапывания объемов 100 и 200 мкл.

Дистиллированная вода высокого качества.

Абсорбирующая (фильтровальная) бумага.

Микропланшетный ридер для считывания абсорбции при 450нм. Рекомендуется использовать бихроматический ридер, способный измерять абсорбцию при 450 и 620 нм одновременно.

Автоматическая отмывочная машина (не обязательна).

Хранение образцов


Образцы сыворотки или плазмы должны храниться при 2-8°С. Для более длительного хранения образцы необходимо заморозить при -20°C.

Процедура исследования


  1. Перед началом исследования все реагенты должны иметь комнатную температуру.

  2. Установить в держателе необходимое число стрипов для постановки калибраторов, контролей и образцов в дублях. Остающиеся стрипы и влагопоглотитель положите в пакет и плотно его закройте.

  3. Раскапать 20 мкл калибраторов и образцов в соответствующие лунки стрипов.

  4. Раскапать 200 мкл конъюгата в лунки.

  5. Инкубировать в течение 60 минут при комнатной температуре, НЕ НАКРЫВАЯ ПЛАШКУ.

  6. Отмывка: удалить аспирацией инкубационную смесь, 3 раза промыть лунки промывочным раствором и удалить оставшуюся жидкость, постучав плашкой по фильтровальной бумаге.

  7. Раскапать 100 мкл хромоген/субстрат смеси в лунки после отмывки.

  8. Инкубировать в течение 15 минут при комнатной температуре.

  9. Остановить реакцию раскапыванием 100 мкл стоп-раствора в лунки в той же последовательности, что и хромоген/субстрат раствор.
  10. Осторожно вытряхнуть микроплашку и считать результаты при 450 нм в течение 10 мин после прекращения реакции.



ЗАМЕЧАНИЯ ПО ПРОЦЕДУРЕ

  1. Общее время раскапывания калибраторов, контролей и образцов на целую плашку не должно превышать 15 минут.

    1. Протокол отмывки – рекомендуется использование автоматического отмывочного оборудования. После последнего цикла отмывки, постучите перевернутой плашкой по абсорбирующей бумаге для удаления из лунок оставшихся капель.

    2. Необходимы 3 цикла отмывки.

    3. Для получения точных результатов необходимо раскапывать хромоген/субстрат раствор непосредственно после отмывки.

    4. Нет необходимости инкубировать плашку в темноте. Однако избегайте прямых солнечных лучей.

    5. В связи с тем, что ферментативная реакция зависит от температуры, полученные величины абсорбции могут быть получены в соответствии с температурой в лаборатории. Если абсорбция нулевого калибратора ниже 1,3 или выше 2,0, в связи с тем, что температура в лаборатории ниже 21°C или выше 28°C, последующие циклы должны производиться при времени инкубации для формирования цвета 20 и 10 минут соответственно.

    6. Однако в случае получения абсорбций выше 2.0 нет необходимости уменьшать инкубационное время ферментативной реакции, т.к. микропланшентый ридер линеен до 2,5-3,0 единиц абсорбции


ПОДСЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ

Постройте стандартную кривую, используя любую миллиметровую или логарифмическую сетчатую бумагу. Нанесите средние значения абсорбции (Y) Стандартов против их концентрации (Х) в нг/ мл. Для построения стандартной кривой мы рекомендуем четырех-параметровую логическую функцию.

Используйте среднюю величину абсорбции каждой пробы для интерполяции концентрации кортизола путем простого наложения данных на указанную кривую. Эту величину при необходимости следует умножить на величину разведения пробы, если таковое осуществлялось.

Результаты можно также подсчитать с помощью программ для автоматической обработки данных, на пример, 4 Parameters, Spline, Logit-Log.


Если концентрация кортизола превысит наивысшие значения калибратора, разведите образцы нулевым калибратором и переделайте анализ. Умножьте полученный результат на коэффициент разведения.
ОГРАНИЧЕНИЯ ПРОЦЕДУРЫ


  • Надежные результаты можно получить лишь при полном понимании инструкций и следовании им.

  • Нельзя смешивать реагенты из разных наборов и партий. Рекомендуется не менять стрипы разных плашек даже из наборов одной партии.

  • Не используйте наборы после истечения срока годности.

  • Не используйте липидемические или сильно гемолизированные образцы.

  • Антитела показывают перекрестную реакцию с дезоксикортизолом и преднезолоном.


ОЖИДАЕМЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ

Содержание кортизола в сыворотке или плазме находится в диапазоне от 50 до 230 нг/мл (138 - 635 нмоль/л) в 8:00 - 10:00 часов и от 30 до 150 нг/мл (82.8 – 414 нмоль/л) в 16:00 часов.
ХАРАКТЕРИСТИКИ АНАЛИЗА

Минимальный определяемый уровень

примерно 2.5 нг/мл (6.9 нмоль/мл).

Специфичность

Специфичность определялась по методу Абрахама:

Стероид

Перекрестная реакция

Кортизол

100%

Кортикостерон

45,0%

Дезоксикортизол

<2,0%

Прогестерон

<9,0%

Дексаметазон

<2,0%

Эстриол

<0,01%

Эстрон


<0,01%

Тестостерон

<0,01%

Точность


Интра-тест

Сыворотка






нг/нмоль

Коэф. Вариации %

1

20

43,5

8,1

2

20

226,5

3,2

3

20

403,6

5,6


Интер-тест

Сыворотка




нг/нмоль

Коэф. Вариации %

1

55

6,6

2

209

3,2

3

361

5,6


Тест на воспроизводимость

Сыворотка

Дополнительный кортизол


нг/мл


Измеряемые конц.

нг/мл

Ожидаемые конц.

нг/мл

Воспроизводимость %

1

0,0

200

400

800

57

110

216

436

57,0

128,5

228,5

428,5

100

86

95

102

2

0,0

200

400

800

240

210

356

514

240

220

320

520

100

95

111

99

3

0,0

200

400

800

378

263

355

558

378

289

389

589

100

91

91

95



Тест на разведение

Сыворотка

Коэффициент разведения

Средняя конц.

нг/мл

Воспроизводимость

%

1

Не разведенный

1:2

1:4

1:8

1:16

48,0


22,0

12,9

6,0

3,3


-

92

108

100

110

2

Не разведенный

1:2

1:4

1:8

1:16

255,0

118,0

63,1

34,2

15,9

-

93

99

107

100

3

Не разведенный

1:2

1:4

1:8

1:16

427

19

97

50

25

-

89

91

94

94



ЛИТЕРАТУРА

1. Tietz, N.W. Testbook of Clinical Chemistry, Saunders, 1986.