refik.in.ua 1

DRG® Инсулин (EIA-2935)


Только для диагностического использования in vitro

Иммуноферментный анализ для количественного определения Инсулина в сыворотке, плазме или моче человека.

Инсулин – главный гормон, ответственный за контроль метаболизма глюкозы. Он синтезируется клетками островков Лангерганса в виде прекурсора проинсулина, который расщепляется на С-пептид и инсулин. Оба синтезируются в эквимолярных количествах в кровоток. Полноценная молекула инсулина представляет собой две полипептидные цепи: цепь А и цепь B (21 и 30 аминокислот соответственно). Две цепи соединяются между собой двумя межцепными дисульфидными мостиками. Существует также внутрицепной дисульфидный мостик в цепи А.

Секреция инсулина в основном контролируется концентрацией глюкозы в плазме. Гормон имеет несколько важных метаболических действий. Его главная функция – контролировать выработку и утилизацию глюкозы в периферических тканях через транспортеров глюкозы. Это и некоторые гипогликемические действия, такие как ингибирование печеночного глюконеогенеза и гликогенолиза, противодействуют гипергликемическим гормонам: глюкагону, эпинефрину (адреналину), гормону роста и кортизолу.

Инсулин резко снижен при инсулинзависимом сахарном диабете (ИЗСД) и при некоторых других состояниях, таких как гипопитуитаризм. Уровень инсулина повышен при инсулиннезависимом сахарном диабете (ИНСД), ожирении, инсулиномах и при некоторых эндокринных дисфункциях, таких как Синдром Иценко-Кушинга и акромегалия.
ПРИНЦИП АНАЛИЗА

Набор DRG® Insulin – твердофазный меченный ферментом иммунсорбентный анализ (ELISA) основан на принципе сэндвича. Микротитровальные лунки покрыты моноклональными антителами к уникальному антигенному сайту на молекуле инсулина. Аликвота с образцом пациента, содержащим инсулин, инкубируется в покрытой лунке с ферментным конъюгатом, представляющим из себя анти-инсулиновое АТ, конъюгированное с биотином. После инкубации несвязавшийся конъюгат вымывается. Во время второй инкубации ферментный комплекс стрептавидин-пероксидаза связывается с биотинилированным АТ. Количество связавшегося пероксидазного комплекса пропорционально концентрации инсулина в образце. Добавив раствор субстрата, измеряют интенсивность образовавшегося окрашивания, пропорциональную концентрации инсулина в образце пациента.

ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ ДЛЯ ПОЛЬЗОВАТЕЛЕЙ


  • Этот набор только для диагностического использования in vitro.

  • ВНИМАНИЕ: Не существует методов тестирований, на 100% гарантирующих отсутствие компонентов вируса Гепатита Б, ВИЧ (HIV/HTLV-III/LAV), или других инфекций. Поэтому все продукты, содержащие компоненты человеческой крови должны рассматриваться как потенциально инфицированные. Поэтому при работе с ними необходимо соблюдать все меры предосторожности, установленные в лабораторной практике.

  • Избегайте контакта кожи со Стоп-раствором – 0.5M H2SO4. Это может вызвать раздражения и ожоги.

  • Немедленно после использования закройте реагенты крышками. Не путайте крышки от реагентов.

  • Растворы, содержащие добавки или консерванты, такие как азид соды, не должны использоваться в ферментной реакции.

  • Не используйте в исследовании компоненты из наборов разных Лотов.


КОМПОНЕНТЫ НАБОРА

В набор входит:

  1. Планшет с микролунками, 12х8 стрипов, 96 лунок.

Лунки покрыты анти-Инсулиновыми моноклональными АТ.

  1. Нулевой стандарт, 3 мл, готов к исп.

  2. Набор стандартов, 5 флаконов по 1 мл, готовы к исп.

Концентрации: 6.25 – 12.5 – 25 – 50 – 100 мкМЕ/мл

  1. Ферментный конъюгат, 5 мл, готов к исп.

  2. Ферментный комплекс, 7 мл, готов к исп.

Содержит комплекс пероксидаза хрена-стрептавидин.

  1. Субстрат - TMB, 14 мл, готов к исп.

  2. Стоп-раствор, 14 мл.

Содержит 0,5 М H2SO4..

  1. Промывочный раствор, 30 мл (концентрированный, 40X).

Внимание: дополнительный нулевой стандарт имеется в наличии по требованию.

Материалы, необходимые для исследования, но не включенные в набор:


1. Микропланшетный ридер (450±10 нм), например DRG E-LIZA MAT 3000

2. Прецизионные микропипетки с одноразовыми наконечниками.

3. Абсорбирующая бумага

4. Дистиллированная вода
Условия хранения набора

При температуре хранения от 2 до 8°С невскрытые реагенты сохраняют активность до истечения срока годности. После истечения этой даты реагенты использовать не рекомендуется.

После восстановления любой раствор стандарта может храниться при 2-8°С в течение 8 дней. При –20С раствор может храниться значительно дольше.

Конъюгат, ферментный комплекс, субстрат, промывочный буфет и нулевой стандарт должны храниться при 2-8°С

Микропланшета должна храниться при 2-8°С. После вскрытия фольгированного пакета при хранении пакет необходимо держать плотно закрытым. Иммуноактивность лунок сохраняется приблизительно в течение 6 недель при хранении во вскрытом, но плотно закрытом пакете с влагопоглотителем.
Подготовка реагентов

Перед использованием необходимо довести все реагенты и необходимое количество стрипов до комнатной температуры.
Промывочный раствор

Развести 30 мл концентрированного промывочного раствора с 1170 мл деионизированной воды, общий объем 1200 мл. Разбавленный промывочный раствор хранится в течение 2 недель при комнатной температуре.
Устранение набора

Устранение набора необходимо осуществлять в соответствие с правилами национальной безопасности. Вся необходимая информация о данном наборе предоставлена в Паспорте безопасности данных.
Поврежденные наборы

В случае серьезного повреждения набора или его компонентов, необходимо проинформировать об этом компанию ДРГ в письменной форме не позднее 1 недели после получения набора. Не рекомендуется тестировать поврежденные наборы.
ОБРАЗЦЫ

Сыворотка или плазма (только гепарин или цитрат плазма) могут использоваться в данном исследовании.


Не использовать гемолитические, желтушные или липемические образцы.

Забор образцов

Сыворотка

Забрать кровь стандартным методом венепункции, дать свернуться и отделить сыворотку центрифугированием при комнатной температуре.

Плазма

Собрать всю кровь в центрифужные пробирки с антикоагулянтом и сразу же после забора центрифугировать.

Хранение образцов

Образцы должны быть закрытыми, их необходимо хранить в течение 5 дней при температуре 2-8°С и должны быть заморожены до –20°С или ниже для хранения в течении более длительного периода.

Избегайте повторных разморозок.

Разведение образцов

В случае если в исходном анализе концентрация инсулина в образце больше чем в наивысшем стандарте, образцы необходимо разводить в 10 или 100 раз с нулевым стандартом и исследовать повторно, как описано в процедуре исследования.

Для подсчета концентраций необходимо принимаить во внимание данный фактор разведения образцов.

Например:

а) разведение 1:10: 10 мкл Сыворотки + 90 мкл Нулевого стандарта (тщательно перемешать)

б) разведение 1:100: 10 мкл раствор а) 1:10 + 90 мкл Нулевой стандарт (тщательно перемешать)
Процедура исследования:


  • Все реагенты и образцы перед началом исследования должны иметь комнатную температуру. Все реагенты должны быть перемешаны без образования пены.

  • После начала исследования все шаги должны быть завершены без остановок

  • Для каждого образца, реагента и стандарта необходимо использовать новые одноразовые наконечники пипеток.
  • Абсорбция - это функция, линейно пропорциональная инкубационному времени и температуре. До начала исследования рекомендуется приготовить все реагенты, снять крышки, установить в держателе необходимые лунки, и т.д. Этим Вы обеспечите равное время для каждого раскапывания без остановок.


  • Как правило, ферментная реакция линейно пропорциональна времени и температуре.

Все стандарты, образцы и контроли необходимо исследовать в дублях с тем, чтобы обеспечить одинаковые условия исследования.

  1. Установите необходимое количество лунок в держателе

  2. Раскапать по 25 мкл стандартов, контролей и образцов новыми одноразовыми наконечниками в соответствующие лунки

  3. Раскапать 25 мкл конъюгата в каждую лунку.

  4. Тщательно перемешать в течение 10 секунд.

  5. Инкубируйте в течение 30 мин при комнатной температуре, не накрывая плашку.

  6. Резко вытряхните содержимое лунок.

Промыть лунки 3 раза разведенным промывочным раствором (400 мкл/лунка)

Резко постучите плашкой об абсорбирующую бумагу, чтобы удалить остатки влаги.

Важно: точность и чувствительность данного анализа зависит от четко выполненной процедуры промывки!

  1. Раскапать 50 мкл ферментного комплекса в каждую лунку.

  2. Инкубировать в течение 30 минут при комнатной температуре.

  3. Резко вытряхните содержимое лунок.

Промыть лунки 3 раза разведенным промывочным раствором (400мкл/лунка). Резко постучите плашкой об абсорбирующую бумагу, чтобы удалить остатки влаги.

  1. Раскапать 50 мкл субстрата в каждую лунку.

  2. Инкубировать в течение 15 минут при комнатной температуре.

  3. Остановить ферментную реакцию добавлением 50 мкл стоп-раствора в каждую лунку.

  4. Считать оптическую плотность при 450±10 нм. микропланшетным ридером в течение 10 минут после добавления стоп раствора.


Подсчет результатов:

  1. Подсчитать средние значения абсорбции для каждого стандарта, контроля и образца пациента.
  2. Постройте стандартную кривую соотношением средней абсорбции (У) каждого референс-стандарта к соответствующей концентрации (Х) в нг/мл.


  3. Используя среднюю абсорбцию каждого образца, определите соответствующую величину Инсулина простой интерполяцией от этой стандартной кривой, при необходимости умножая на коэффициент разведения.

  4. Автоматический метод: компьютерные программы, использующие кубический сплайн, 4 PL (4-хпараметровая логистика) или логит-лог преобразование.

  5. Концентрацию образцов можно считывать непосредственно со стандартной кривой. Образцы с концентрацией инсулина, превышающей самый высокий стандарт, необходимо разводить еще раз. Для подсчета концентраций необходимо принимать во внимание данный фактор разведения.

Ниже приведен пример стандартной кривой Инсулина ELISA.

Стандарт

Оптические величины (450 нм)

Стандарт 0 (0 мкМЕ/мл)

0,03

Стандарт 1 (6,25 мкМЕ/мл)

0,07

Стандарт 2 (12,5 мкМЕ/мл)

0,14

Стандарт 3 (25 мкМЕ/мл)

0,35

Стандарт 4 (50 мкМЕ/мл)

0,88

Стандарт 5 (100 мкМЕ/мл)

2,05
Ожидаемые величины

Для каждой лаборатории рекомендуется устанавливать свои собственные нормальные и ненормальные значения.

Концентрации инсулина у здоровых людей варьируются от 2 до 25 мкМЕ/мл (предварительные результаты).
Характеристики исследования:

Динамический диапазон исследования


Диапазон данного исследования варьируется от 0 – 100 мкМЕ/мл.

Чувствительность

Нижний предел обнаружения Инсулина < 1,5 мкМЕ/мл, подсчитан как 2 стандартных отклонения от нулевого стандарта.

Специфичность антител (кросс-реактивность)

Кросс-реактивность определялась добавлением различных аналитов к сыворотке, содержащей 4 нг/мл (100 мкМЕ/мл) инсулина и измерением возможной концентрации инсулина.

Аналит (4 нг/мл)

Содержание инсулина нг/мл

Кросс-реакция (%)

Свиной инсулин 8 нг/мл

Овечий инсулин 8 нг/мл

Собачий инсулин 16 нг/мл

Кроличий инсулин 16 нг/мл

Крысиный инсулин 16 нг/мл

Человеческий проинсулин 32 нг/мл

Свиной проинсулин 16 нг/мл

Овечий проинсулин 16 нг/мл

17

17,8

17,2

14,1

4,0

4,1

4,0

4,1

>100

>100

82

63

0

0

0

0



Аналитическая чувствительность:

Аналитическая чувствительность была подсчитана с помощью среднего значения + 2 стандартных отклонения двадцати повторных анализов нулевого стандарта = 1,76 мкМЕ/мл.
Точность
Интра-анализ
Образец

n

Среднее значение мкМЕ/мл

Коэф. Вариации (%)

1


20

17,45

2,6

2

20

66,43

1,79


Интер-анализ
Образец

n

Среднее значение мкМЕ/мл

Коэф. Вариации (%)

1

12

17,36

2,88

2

12

66,90

5,99

Контроль качества

Рекомендуется использовать контрольные образцы в соответствие с нормами федеральных и государственных прав. Использование контрольных образцов обеспечивает достоверность результатов анализа. Используйте контроли на нормальном и патологическом уровнях.

Контроли и соответствующие результаты Лаборатории контроля качества указаны в сертификате контроля качества, который прилагается к набору. Значения и диапазоны, указанные в сертификате контроля качества всегда соответствуют данному лоту набора и должны использоваться для прямого сравнения результатов.

Так же рекомендуется использовать национальные или международные программы оценки качества для обеспечения точных результатов анализа.

Используйте соответствующие статистические методы для анализа контрольных значений и отклонений. Если результаты анализа не соответствуют установленным допустимым диапазонам контрольных материалов, результаты пациента необходимо рассматривать как недействительные. В этом случае, проверьте следующие технические данные: приборы для пипетирования, фотометр, срок годности реагентов, условия хранения и инкубации, аспирационные и промывочные методы.


В случае проверки всех выше перечисленных пунктов вы не обнаружили никаких неисправностей, обратитесь к вашему дистрибьютеру или же непосредственно в компанию ДРГ.

Воспроизведение

Образцы были обогащены путем добавления раствора Инсулина с концентрацией 1:1. Ожидаемые значения подсчитаны с помощью добавления половины значений, установленных для неразведенных образцов и половины значений известных растворов. Процент воспроизведения подсчитан путем умножения коэффициента измерений и ожидаемых значений на 100.

Образец

Добавленная концентрация 1:1 (v/v) (мкМЕ/мл)

Измеряемые концентрации

(мкМЕ/мл)

Ожидаемые концентрации

(мкМЕ/мл)

Воспроизведение

%

1


100

50

25

12,5

21,24

66,41

38,80

23,38

17,37


60,62

35,62

23,12

16,87


109,6

108,9

101,1

102,9

2


100

50

25

12,5

69,04

84,58

58,39

43,17

37,48


84,52

59,52

47,02

40,77


100,1

98,1

91,8

91,9


Линейность

Образец

Разведение


Измеряемые

концентрации (мкМЕ/мл)

Ожидаемые концентрации (мкМЕ/мл)

Воспроизведение

(%)

1

Неразведенная

1:2

1:4

1:8

1:16

21,24

9,40

5,23

2,81

1,47

21,24

10,62

5,31

2,66

1,33


88,5

98,5

105,9

110,3

2

Неразведенная

1:2

1:4

1:8

1:16

69,04

30,51

17,60

8,73

4,76

69,04

34,52

17,26

8,63

4,32


88,4

102,0

101,2

110,4



ОГРАНИЧЕНИЯ ПРОЦЕДУРЫ

Мешающие вещества

Любое неправильное обращение с образцами или модификация данного теста могут повлиять на результат.

Гемоглобин (до 4 мг/мл), билирубин (до 0,5 мг/мл) и триглицериды (до 30 мг/мл) не влияют на результаты.
Влиянеие лекарств

На сегоднешний момент ни одно лекарство не может повлиять на кол-во инсулина в образце.
Эффект крюка

Не наблюдалось до 1600 мкМЕ/мл инсулина.
ЛИТЕРАТУРА

См. оригинал на англ. языке.