refik.in.ua 1


Пролактин EIA-1291

Пересмотрено 17 мая 2006 г.


Только для диагностического использования in vitro

Набор для количественного и качественного определения Пролактина иммуноферментным методом в человеческой сыворотке.


Номер по каталогу: EIA-1291
Клиническая значимость

Человеческий пролактин (лактогенный гормон) секретируется передней долей гипофиза у мужчин и женщин. Пролактин – полипептид, состоящий из одной цепочки, с молекулярной массой 23 000 Да. Выброс и синтез пролактина регулируются нейроэндокринно, преймущественно ПролактоТропным Гормоном и Пролактостатином. У женщин преймущественно уровень пролактина выше чем у мужчин; скорее всего имеет место эстроген-зависимый подъем уровня при половой зрелости, а также связанный с ним спад в менопаузу. Первичная задача пролактиа – способствовать развитию молочных желез и обеспечивать лактацию. Пролактин также подавляет гонадную функцию. Во время беременности уровень гормона повышается в разы (в 10 – 20 раз выше нормы), снижаясь к 3-4 неделе после родов до нормальных значений для небеременных. У кормящих грудью матерей остается высокий уровень пролактина, и пройдет несколько месяцев прежде, чем уровень гормона снизится до уровня небеременных. Определение пролатина полезно при при диагностике гипоталамо-гипофизарных расстройствах. Микроаденомы (маенькие опухоли гипофиза) могут вызывать гиперпролактинемию, которая иногда ассоциируется с мужской импотенцией. Высокий уровень пролактина обычно связан с галакторреей или аменорреей. Выяснено, что концентрация пролактина повышается от эстрогенов, тиролибирина и некоторых лекарственных веществ, поражающих допаминэргические механизмы. Уровень пролактина повышается при почечных заболеваниях, гипотиреоидизме, а также при стрессе, физических упражнениях и гипогликемии. Вдобавок ко всему, выброс пролактина эпизодичен и показывает суточное изменение. Слабо выраженное повышение уровня должны рассматриваться с учетом вышеизложенного материала. Концентрация пролактина может быть увеличена хлоропромазином и резерпином, а снижена бромоциптином и леводопой.

Набор DRG® Prolactin ELISA обеспечивает быстрый, чувствительный и надежный анализ. Антитело, разработанное для этого теста, определит минимальную концентрацию пролактина 0,35 нг/мл, при этом не давая перекрестных рекций с ХГЧ, ТТГ, ЛГ, ФСГ, СТГ.

Принцип анализа

Набор для иммуноферментного анализа DRG® Prolactin - это твердофазный, меченный ферментом, иммуносорбентный анализ (ELISA), основанный на принципе «сендвича». Микротитровальные лунки покрыты моноклональными антителами, направленными против уникального антигенного сайта на молекуле Пролактина. Аликвота пробы пациента с эндогенным Пролактин инкубируется в лунке с ферментным конъюгатом, который из себя представляет моноклональное анти-пролактиновое антитело, конъюгированное с пероксидазой хрена. После инкубации несвязавшийся конъюгат вымывается. Количество связавшейся пероксидазы пропорционально концентрации Пролактина в образце. При добавлении субстратного раствора появится окрашивание, интенсивность которого пропорциональна концентрации Пролактина в пробе пациента.

РЕАГЕНТЫ, ВКЛЮЧЕННЫЕ В НАБОР





  1. Микропланшета: 12х8 (разламываемые) = 96 лунок, покрытые анти-пролактиновыми моноклональным антителом.

  2. Набор референс-стандартов: 6 флаконов (Лиофилизированные), по 1 мл каждый

Концентрации: 0; 5; 20; 50; 100; 200 нг/мл.

Коэффициент пересчета 1 нг/мл = 21,1 мМЕ/мл.

  1. Ферментный конъюгат: 1 флакон, 11 мл, готов к использованию.

Анти-пролактин антитело, конъюгированное с пероксидазой хрена,

содержит 0,3% проклин в качестве консерванта.

  1. Раствор субстрата: 1 флакон, 11 мл, готов к использованию.

Тетраметилбензидин (ТМБ)

  1. Стоп-раствор: 1 флакон, 6 мл, готов к использованию.

Содержит 0,5M H2SO4.

Избегать контакта со стоп-раствором. Может вызвать раздражение кожи и ожеги.
МАТЕРИАЛЫ, НЕОБХОДИМЫЕ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ, НО НЕ ВКЛЮЧЕННЫЕ В НАБОР

1. Микроплашечный ридер (450±10 нм), например DRG E-LIZA MAT 3000

2. Прецизионные микропипетки с одноразовыми наконечниками на 25, 50 и 100 мкл.


3. Дистиллированная вода

4. Aбсорбирубщая бумага
УСЛОВИЯ ХРАНЕНИЯ
При хранении при 2° до 8°C нераспечатанные реагенты сохраняют активность до истечения срока годности. Не используйте реагенты после истечения срока годности. Микропланшеты должны храниться при 2° to 8°C. После вскрытия фольгированного пакета необходимо каждый раз плотно его закрывать. Работоспособность открытого набора сохраняется приблизительно 2 месяца со дня открытия при хранении в выше описанных условиях.
ЗАБОР И ПОДГОТОВКА ПРОБ


  1. Забрать пробу венопункцией, дождаться свертывания, отделить сыворотку центрифугированием при комнатной температуре. Избегайте гемолизных проб.

  2. Образцы могут храниться в закрытых пробирках в течение 5 дней при 2-8°C до начала исследования. Более длительное время образцы сохраняются замороженными при -20°C до начала исследования. Замораживать образцы более 1 раза не рекомендуется. Размороженные образцы необходимо несколько раз перемешать до начала исследования.

  3. В случае, если количество искомого в образце больше, чем в самом высшем стандарте, образец может быть разведен Стандартом 0 и перепроанализирован (см. Процедуру Анализа)



ВНИМАНИЕ! Этот набор предназначен только для работы с сывороткой, и без добавок.
Приготовление реагентов:

Все реагенты и необходимое число стрипов должны быть доведены до комнатной температуры.
Стандарты:

Восстановить лиофилизированное содержимое виалов стандартов, используя 1,0 мл дистиллированной воды.

Примечание: восстановленные стандарты стабильны в течение 2 месяце при 2-8°С. Для длительного хранения заморозить до °20 С.
ПРОВЕДЕНИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
ОБЩИЕ ЗАМЕЧАНИЯ:

1. Все реагенты и образцы перед началом исследования должны иметь комнатную температуру. Все реагенты должны быть перемешаны без образования пены.


2. После начала исследования все шаги должны быть завершены без остановок


  1. Для каждого образца необходимо использовать новые одноразовые наконечники пипеток

  2. Абсорбция - это функция инкубационного времени и температуры. До начала исследования рекомендуется приготовить все реагенты, снять крышки, установить в держателе необходимые лунки, и т.д. Этим Вы обеспечите равное время для каждого раскапывания без остановок.

  3. Настоящий набор предназначен для максимальной абсорбции от 1.0 до 2.0 в течение 10 минут при комнатной температуре (22°C). Если эти величины максимальной абсорбции превышают рабочие пределы Вашего спектрофотометра или менее 1.000, необходимо соответственно уменьшить или увеличить инкубационное время ферментативного формирования цвета. Общее правило таково: ферментативная реакция линейно пропорциональна времени и температуре. Поэтому интерполяция возможна для постоянных физико-химических условий.


ЗАМЕЧАНИЕ ПО ПРОЦЕДУРЕ


  1. Раскапывание вручную: не рекомендуется использовать больше 32 лунок в одном цикле. Раскапывание всех стандартов, образцов и контролей должно быть завершено в течение 3 минут.

  2. Автоматическое раскапывание: в каждом цикле может быть использована вся планшета на 96 лунок. Раскапывание всех стандартов, образцов и контролей должно быть завершено в течение 6 минут.

  3. Все стандарты, образцы и контроли должны ставиться в дублях конкурентно так, чтобы сохранить равные условия теста.


ПРОЦЕДУРА ИССЛЕДОВАНИЯ (Количественный метод)


  1. Установите в рамку требуемое число лунок, покрытых антителами.

  2. Распределите 25 мкл Стандартов, Контролей и Образцов сыворотки новыми одноразовыми наконечниками в соответствующие лунки.

  3. Распределите 100 мкл Ферментного конъюгата в каждую лунку.
  4. Тщательно перемешайте в течение 10 секунд. Необходимо полное смешивание реагентов.


  5. Инкубировать 30 минут при комнатной температуре.

  6. Резко вытряхнуть содержимое лунок.

Промыть 5 раз лунки дистиллированной водой. Резко вытряхнуть на абсорбирующую бумагу оставшиеся в лунках водяные капли.

  1. Добавить 100 мкл Раствора субстрата в каждую лунку.

  2. Инкубировать 10 минут при комнатной температуре.

  3. Остановить ферментативную реакцию добавлением 50 мкл Стоп-раствора в каждую лунку.

  4. Считать оптическую плотность при длине волны 450±10 на микропланшетном ридере в течение 10 минут с момента добавления Стоп-раствора.


ПОДСЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ

  1. Подсчитайте средние величины абсорбции для каждого набора референс-стандартов, контролей и проб пациентов.

  2. Постройте стандартную кривую построением на оси координат: средняя величина абсорбции, полученная от каждого референс-стандарта против его концентрации в нг/млс величиной абсорбции на вертикальной оси(Y) и концентраци на горизонтальной оси(X).

  3. Используя среднюю величину абсорбции для каждого образца, определите соответствующую концентрацию пролактина в нг/мл от стандартной кривой. В зависимости от опыта и/или возможностей компьютера могут применяться другие методы обработки данных.

  4. Автоматический метод подсчета: результаты в инструкции были получены с применением метода 4PL (Четырехпараметровая логистистика). Другие функцие могли бы дать слегка отличные данные.

  5. Любые разбавленные образцы могут быть преобразованы с учетом соответствующего коэффициента разбавления.


Ожидаемые результаты

Каждой лаборатории необходимо установить свои нормальные уровни. Результаты, приведенные ниже, отражают ограниченное число образцов здоровых взрослых.




Мужчины

Женщины

N

30

69

Средние (нг/мл)

6,44

14,27

S.D.

5,50

5,88

Диапазон (нг/мл)

0,94 – 20,94

2,39 – 25,15


Динамика анализа

Рабочий диапазон значений 0 – 200 нг/мл
Чувствительность

Минимальная определяемая концентрация человеческого пролактина для данного теста составляет 0,35 нг/мл.
Точность

A/ в пределах одного теста

Образец сыворотки

1

2

3

Кол-во повторений

10

10

10

Среднее содержание пролактина (нг/мл)

6,16

14,10

32,48

Стандартное отклонение

0,28

0,41

1,91

Коэффициент вариации %

4,58

2,91


5,87


Б/ между различными тестами


Образец сыворотки

1

2

3

Кол-во повторений

12

12

12

Среднее содержание пролактина (нг/мл)

5,96

12,64

25,99

Стандартное отклонение

0,37

0,71

1,53

Коэффициент вариации %

6,22

5,64

5,90


Воспроизводимость и разведение
А. Воспроизводимость


Ожидаемые конценрации нг/мл

Наблюдаемые конценрации нг/мл

Воспроизводимость %

6,42

5,99

93,3

7,25

6,76

93,2

13,90

14,64


105,3

27,14

28,74

105,9

52,40

56,74

107,3

68,57

68,20

99,5


Б. Линейность


пациента

разведение

Ожидаемые конц. нг/мл

Наблюдаемые конц. нг/мл

Воспроизводимость %

1

Неразведенный

1:2

1:4

1:8

1:16

72,65

36,33

18,17

9,09

4,55

72,65

36,88

18,72

9,33

4,63

100,0

101,5

103,0

102,7

101,9

2

Неразведенный

1:2

1:4

1:8

1:16

61,86

30,93

15,47

7,74

3,87

61,86

31,01

16,02

8,06

4,12

100,0

100,3

103,6

104,1

106,5


Специфичность

Тестируемый гормон


Концентрация

Интенсивность цвета экв. Пролактину в сыворотке нг/мл

ХГЧ

100 мМЕ/мл

400 мМЕ/мл

62.500 мМЕ/мл

125.000 мМЕ/мл

250.000 mIU/m

500.000 mIU/m

0

0

0

0

0

0

ТТГ

62.5 IU/ml

125 IU/ml

250 IU/ml

500 IU/ml

0

0

0

0

ЛГ

125 мМЕ/мл

500 мМЕ/мл

1000 мМЕ/мл

0

0

0

ФСГ

125 мМЕ/мл

250 мМЕ/мл

500 мМЕ/мл

0

0

0

СГ

50 ng/ml

1000 ng/ml

0

2.5


Хук-эффект

В данном наборе хук-эффект не наблюдается до 20000 нг пролактина на мл.


Description

Standard

Enzyme-




Substrate



Stop





Results




Sample

Conjugate




Solution




Solution




ng/ml




мкл

мкл




мкл




мкл







Standard 0

25

100

Перемешать в теч.

100

Инкубировать

50

Считать опт.плотность

0

Standard 1

25

100

10 секунд

100

10 минут

50

OD при 450нм

10

Standard 2

25

100

Инкубировать

100

При комн

50

На микроплнш.

20


Standard 3

25

100

30 минут

100

температуре

50

ридере

40

Standard 4

25

100

При комн. Темп.

100




50




100

Standard 5

25

100

Промыть лунки

100




50




200

Sample 1

25

100

5 раз

100




50







Sample 2

25

100




100




50







Sample 3

25

100




100




50







Sample 4

25

100




100




50







Sample 5

25

100




100




50