refik.in.ua 1

«УТВЕРЖДАЮ»
Руководитель Департамента
государственного контроля
лекарственных средств и
медицинской техники МЗ РФ
______________ В.Е. Акимочкин
«25» марта 2003 г.

ИНСТРУКЦИЯ ПО ПРИМЕНЕНИЮ НАБОРА РЕАГЕНТОВ
ДЛЯ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ
СВОБОДНОГО ТИРОКСИНА
В СЫВОРОТКЕ КРОВИ
(ТироидИФА-свободный Т4)

Рекомендована Комиссией по наборам реагентов
для иммуноферментного (неинфекционные),
радиоиммунологического и других видов
иммунохимического анализа Комитета по
новой медицинской технике МЗ РФ
(протокол № 9 от 21 октября 2002 г.)

1. НАЗНАЧЕНИЕ


1.1.
Набор реагентов ТироидИФА-свободныйТ4 предназначен для количественного определения содержания свободного тироксина (Т4) в сыворотке крови человека методом твердофазного иммуноферментного анализа.

1.2. Тироксин — тироидный гормон с молекулярной массой 777 Да. Тироксин является одним из гормонов, синтезируемых щитовидной железой. Количественное определение уровня тироксина в крови имеет диагностическое значение при оценке функционального состояния щитовидной железы. В сыворотке крови тироксин в основном находится в связанном состоянии. Основными тироксин-связывающими белками сыворотки являются: тироксин-связывающий глобулин (ТСГ), тироксин-связывающий преальбумин (ТСПА) и альбумин. Концентрация гормона, не связанного с белками (свободныйТ4), очень мала — приблизительно 0,03% от концентрации общего циркулирующего гормона. Считается, что биологически активным является именно свободный гормон.

Концентрация свободногоТ4 не зависит от уровня связывающих белков и остается в пределах нормы как при повышенных (врожденная патология, беременность, исполь­зование оральных эстрогенов и контрацептивов), так и при пониженных уровнях ТСГ (врожденная патология, использование андрогенов или салицилатов, почечная недостаточность), а также в случае понижения связывающей способности белков (использование салицилатов). Таким образом, уровень свободногоТ4 отражает истинный тироидный статус. Его концентрация превышает уровень нормы при гиперфункции щитовидной железы или в результате употреблении препаратов, содержащих тироксин. Уровень свободного Т4 находится ниже нормы при гипофункции щитовидной железы.


1.3. Набор рассчитан на проведение анализа в дубликатах 40неизвестных, 6калибровочных проб, одной контрольной проб и одной пробы для определения оптической плотности раствора тетраметилбензидина при использовании всех стрипов одновременно.

Примечание: В случае дробного применения набор может быть использован в течение месяца после вскрытия компонентов набора.

 

2. ПРИНЦИП РАБОТЫ НАБОРА

Принцип работы набора состоит в следующем. В лунках, при добавлении исследуемого образца и конъюгата тироксин-пероксидаза, во время инкубации устанавливается равно­весие между конъюгатом и свободным Т4 сыворотки крови за связывание с антителами, иммобилизованными на внутренней поверхности лунок. При удалении содержимого из лунок происходит разделение свободного и связанного антителами конъюгата тироксин-пероксидаза, причем количество связанного антителами конъюгата обратно пропорционально количеству свободногоТ4 в образце сыворотки крови.

Во время инкубации с ТМБ происходит окрашивание раствора в лунках. Степень окраски прямо пропорцио­нальна количеству связанного антителами конъюгата тироксин-пероксидаза. После измерения оптической плотности раствора в лунках на основании калибровочного графика рассчитывается концентрация свободного Т4 в исследуемых образцах.

 

3. СОСТАВ НАБОРА:

· Комплект из двенадцати восьмилуночных стрипов в рамке с иммобилизованными на внутренней поверхности лунок моноклональными антителами к тироксину, маркирован «Стрипы с моноклональными антителами к тироксину» — 1 пакет;

· калибровочные пробы на основе сыворотки крови человека, содержащие известные количества свободногоТ4; значения концентраций свободногоТ4 в калибровочных пробах указаны на этикетках флаконов — 6флаконов (лиофилизованные препараты или жидкости по 0,5 мл);

· конъюгат тироксина с пероксидазой, маркирован «Конъюгат Е» — 1 флакон (18мл);


· концентрированный буферный раствор для промывки лунок, маркирован «Буфер Р» — 1 флакон (20 мл);

· раствор тетраметилбензидина, маркирован «Раствор ТМБ» — 1 флакон (14мл);

· стоп-реагент, маркирован «Стоп-реагент» (1Н соляная кислота) — 1 флакон (14мл);

· контрольная сыворотка на основе сыворотке крови человека с известным содержанием свободногоТ4, марки­рована «Контрольная сыворотка» — 1 флакон (лиофилизованный препарат или жидкость 0,5 мл).

 

4. АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ НАБОРА

4.1. Специфичность. Перекрестная реакция антител к тироксину с другими тироидами приведена в таблице.

Таблица


ТИРОИД

Перекрестная реакция, %

L-Тироксин

L-Трийодтиронин L-Дийодтирозин

100,0

8,0   

0,001

4.2. Коэффициент вариации результатов определения свободного Т4 в одном и том же образце сыворотки крови с использованием набора ТироидИФА-свободныйТ4 не превышает 8%.

4.3. Чувствительность. Минимальная достоверно определяемая набором концентрация свободногоТ4 в сыворотке крови человека не превышает 1,0 пмоль/л.

4.4. Клиническая проверка. Содержание свободногоТ4 измеряли в сыворотке крови, взятой с 9 до 11часов у200здоровых лиц в возрасте 18–45 лет. Диапазон измеренных концентраций составил 10,0–23,2 пмоль/л. Этот диапазон может быть использован в качестве ориентировочного показателя нормы.

4.5. Рекомендуется в каждой лаборатории при использо­вании набора уточнить значения концентраций свободного Т4, соответствующие нормальным.

 

5. МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ

5.1. Потенциальный риск применения набора — класс 2а.

5.2. Все компоненты набора в используемых концентрациях являются нетоксичными.

5.3. При работе с набором следует соблюдать «Правила устройства, техники безопасности, производственной санитарии, противоэпидемического режима и личной гигиены при работе в лабораториях (отделениях, отделах) санитарно-эпидемиологических учреждений системы Министерства здравоохранения СССР» (Москва,1981 г.).

5.4. Стоп-реагент представляет собой 1Н раствор соляной кислоты. Избегать разбрызгивания и попадания на кожу и слизистые. В случае попадания раствора стоп-реагента на кожу и слизистые необходимо промыть пораженный участок большим количеством проточной воды.

5.5. При работе с набором следует надевать одноразовые резиновые или пластиковые перчатки, т.к. образцы и производные крови человека являются потенциально инфицированным материалом, способным длительное время сохранять и передавать ВИЧ, вирус гепатита или любой другой возбудитель вирусных инфекций.

5.6. Химическая посуда и оборудование, которые используются в работе с набором, должны быть соответствующим образом маркированы и храниться отдельно.

5.7. Запрещается прием пищи, использование космети­ческих средств и курение в помещениях, предназначенных для работы с наборами.

 

6. ОБОРУДОВАНИЕ И МАТЕРИАЛЫ, НЕОБХОДИМЫЕ ПРИ РАБОТЕ С НАБОРОМ:

· Спектрофотометр вертикального сканирования, позволяющий измерять оптическую плотность раствора в стрипах при длине волны 450 нм;

· прибор для встряхивания рамки со стрипами (термо­статируемый шейкер), позволяющий производить встряхи­вание со скоростью 500–800 об/мин при температуре + 37°С;

· пипетки полуавтоматические одноканальные со сменными наконечниками с изменяемым объемом отбора жидкостей: на 5–50 мкл; на 40–200 мкл; на 200–1000 мкл; на 1000–5000 мкл;


· пипетка полуавтоматическая восьмиканальная со сменными наконечниками, позволяющая отбирать объемы жидкости до 300 мкл;

· цилиндр мерный, позволяющий отмерять 200 мл;

· стакан стеклянный вместимостью 300 мл;

· вода дистиллированная;

· бумага фильтровальная;

· перчатки резиновые или пластиковые.

 

7. ПОДГОТОВКА РЕАГЕНТОВ ДЛЯ АНАЛИЗА

7.1. Калибровочные пробы и контрольная сыворотка.

Для восстановления лиофилизованных калибровочных проб и контрольной сыворотки перед вскрытием флаконов легким постукиванием стряхнуть частицы, прилипшие к стенкам флаконов или к пробкам. Открыть флаконы и положить пробки перевернутыми на сухую поверхность. В каждый флакон с калибровочной пробой и контрольной сывороткой внести по 0,5мл дистиллированной воды и закрыть пробки. Выдержать флаконы в течение 10минут при комнатной температуре (+18...25°С). Затем, аккуратно наклоняя и вращая флаконы, пере­мешать их содер­жимое до полного растворения, избегая пенообразования. В течение следующих 10минут выдержать флаконы при комнатной температуре (+18...25°С), периодически перемешивая.

Жидкие калибровочные пробы и контрольная сыворотка готовы к использованию.

7.2. Стрипы. Перед вскрытием пакет со стрипами необ­ходимо выдержать при комнатной температуре в течение времени не менее 30 минут. Открыть пакет и переставить на свободную рамку необходимое количество стрипов. Оставшиеся стрипы хранить в пакете с герметично закрытым замком при температуре +2...8°С в течение всего срока годности.

7.3. Промывочныйбуфер. Необходимое количество БуфераР развести дистиллированной водой в 10раз. Например:

5мл БуфераР + 45мл дистиллированной воды.

Тщательно перемешать, избегая пенообразования. Хранить закрытым при комнатной температуре не более 5суток. Оставшийся неиспользованным Буфер Р хранить закрытым при температуре +2...8°С в течение всего срока годности.


7.4. Конъюгат Е готов к использованию.

7.5. Раствор ТМБ готов к использованию.

7.6. Стоп-реагент готов к использованию.

 

8. ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА

8.1. Все реагенты перед проведением анализа должны быть тщательно перемешаны и доведены до комнатной температуры. На последней странице приведена схема проведения анализа.

8.2. Составить протокол маркировки лунок. Лунки промаркировать следующим образом:

А1, А2 — №1 для измерения величины оптической плотности раствора ТМБ;

В1, В2 — №2 для калибровочной пробы №1;

С1, С2 — №3 для калибровочной пробы №2;

D1, D2 — №4 для калибровочной пробы №3;

E1, E2 — №5 для калибровочной пробы №4;

F1, F2 — №6 для калибровочной пробы №5;

G1, G2 — №7 для калибровочной пробы №6;

H1, H2 — №8 для контрольной сыворотки.

8.3. Внести в соответствующие лунки по 20 мкл калибровочных проб и контрольной сыворотки, в оставшиеся лунки по 20 мкл исследуемой сыворотки в дубликатах.

8.4. Во все лунки, кроме А1 и А2, внести по 150 мкл конъюгата Е.

8.5. Инкубировать стрипы при встряхивании в течение 1часа в термостатируемом шейкере при температуре +37°С со скоростью 500–800 об/мин.

8.6. По окончании инкубации удалить содержимое лунок декантированием и промыть лунки четыре раза. При каждой промывке во все лунки добавить по 300 мкл промывочного буфера, приготовленного по п. 7.3, встряхнуть рамку на шейкере в течение 5–10сек. с последующим декантированием. После последнего декантирования тщательно удалить остатки жидкости из лунок постукиванием рамки со стрипами в перевернутом положении по фильтровальной бумаге.

8.7. Немедленно внести во все лунки по 100мкл раствора ТМБ. Инкубировать стрипы в темноте при комнатной темпе­ратуре (+18…25°С) в течение 15–30 минут в зависимости от степени развития окраски.


8.8. Добавить во все лунки с той же скоростью и в той же последовательности, как и раствор ТМБ, по 100мкл стоп-реагента для остановки ферментной реакции, встряхивать на шейкере в течение 1–2 минуты.

8.9. Измерить на фотометре вертикального сканирования оптическую плотность раствора в лунках при длине волны 450 нм. Если программа фотометра позволяет вычитать величину оптической плотности в лунках А1 и А2 из значений оптических плотностей всех остальных лунок, то для расчетов необходимо использовать формулу В/В0х100% для каждой калибровочной или исследуемой пробы, где В— среднее арифметическое значение оптической плотности в лунках, содержащих калибровочные или исследуемые пробы, В0 — среднее арифметическое значение оптической плотности в лунках, содержащих калибровочную пробу 0пмоль/л. В координатах «Logit-log» построить калибровочный график зависимости В/В0х100% от концентрации свободногоТ4 в калибровочных пробах (пмоль/л).

Если фотометр не позволяет вычитать величину оптической плотности лунок А1 и А2, то необходимо пользоваться формулой (В-ВТ)/(B0-BТ)х100%, где ВТ — среднее арифметическое значение оптической плотности лунок А1 и А2.

Определить содержание свободногоТ4 в пробах по калибровочному графику.

8.10. Если по техническим причинам невозможно измерить оптическую плотность в лунках планшета непосредственно после выполнения п.8.8, то следует иметь ввиду, что окраска в лунках планшета стабильна в течение времени не более 20 минут при температуре +2...8°С.

 

9. УСЛОВИЯ ХРАНЕНИЯ И ЭКСПЛУАТАЦИИ НАБОРА

9.1. Набор ТироидИФА-свободныйТ4 должен храниться в упаковке предприятия-изготовителя при температуре +2...8°С в течение всего срока годности. Допускается хранение набора при температуре до +25°С не более 5суток.

Срок годности набора — 12 месяцев.


В случае дробного использования компоненты набора необходимо хранить следующим образом:

· стрипы хранить в герметично закрытом пакете с замком при температуре +2...8° в течение всего срока годности;

· конъюгат Е и раствор ТМБ после вскрытия флаконов хранить не более одного месяца при температуре +2...8°C;

· восстановленные (растворенные) из лиофилизованных препаратов калибровочные пробы и контрольную сыворотку хранить при температуре +2...8°С не более 1 месяца;

· жидкие, готовые к использованию, калибровочные пробы и контрольную сыворотку после вскрытия флаконов хранить не более 1 месяца при температуре +2...8°С;

· промывочный буфер, подготовленный к использованию, хранить закрытым не более 5суток при комнатной температуре (+18…25°С);

· БуферР и стоп-реагент после вскрытия флаконов хранить при температуре +2..8°С в течение всего срока годности.

9.2. Для проведения анализа не следует использовать плазму крови, гемолизированную, мутную сыворотку, а также сыворотку, содержащую азид натрия.

9.3. При вскрытии и растворении лиофилизованных компонентов необходимо следить, чтобы на крышке и стенках флаконов не оставалось сухого вещества.

9.4. Пробы сыворотки крови хранить при температуре +2...8°С не более 2дней; при необходимости более длитель­ного хранения — при температуре –20°С и ниже. Избегать повторных циклов замораживания-размораживания.

9.5. При использовании набора для проведения нескольких независимых серий анализов необходимо иметь в виду, что для каждого независимого эксперимента необходимо построение нового калибровочного графика и рекомендуется определение концентрации свободного Т4 в контрольной сыворотке.

9.6. Запрещается использовать стоп-реагенты из наборов реагентов других фирм-производителей.

9.7. Для получения надежных результатов необходимо строгое соблюдение инструкции.


По вопросам качества набора «ТироидИФА-свободныйТ4» обращаться по адресу: 189650, г.Санкт-Петербург, п.Песочный, ул. Ленинградская, д. 70/4, тел/факс: (812) 596-67-80, или в ИГКЛС ФГУ «НЦ ЭСМП» МЗ РФ по адресу: 117246, Москва, Научный проезд, д. 14 А, тел. (095) 120-60-95.

СХЕМА ПРОВЕДЕНИЯ АНАЛИЗА


Стадия анализа
и реагенты

Номер пары лунок в соответствии с маркировкой по п. 8.2.

1

2

3

4

5

6

7

8

9–48

КП № 1, мкл



20















КП № 2, мкл





20












КП № 3, мкл








20











КП № 4, мкл









20









КП № 5, мкл











20







КП № 6, мкл













20





КС, мкл















20



СХ, мкл















20

Конъюгат тироксин-пероксидаза, мкл



150

150

150

150

150

150

150

150

Инкубация № 1

1 час, термостатируемый шейкер, +37°С

4-кратная промывка:
промывочный
буфер, мкл


300


300


300


300


300


300


300


300


300

Раствор ТМБ, мкл

100

100

100

100

100

100

100

100

100

Инкубация № 2

КT, темное место, 15–30 минут

Стоп-реагент, мкл

100

100

100

100

100

100

100

100

100

Перемешивание


Шейкер, 1–2 минуты

Измерение ОП р-ров
в лунках стрипов

Спектрофотометр, 450 нм

Расчет результатов

Калькулятор и масштабная бумага либо
соответствующая компьютерная программа



Примечания:
КП — калибровочная проба;
КС — контрольная сыворотка;
С
Х — анализируемые пробы;

ОП — оптическая плотность;
КT — комнатная температура (+18...25°С).




Инструкция составлена сотрудниками ЗАО «Алкор Био»:
зав. лабораторией биотехнологии В.А. Головаченко

и ген. директором, к.б.н. Д.Г. Полынцевым